Pseudomonas aeruginosa dan Escherichia coli adalah patogen oportunistik dari kelompok bakteri gram negatif yang menyebabkan infeksi pada tubuh manusia. Kedua spesies tersebut sering ditemukan telah resisten terhadap beberapa antibiotik. Kloramfenikol merupakan antibiotik yang sering digunakan untuk mengatasi infeksi bakteri tersebut, salah satu gen pengendali resistensi kloramfenikol adalah gen cat. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi keberadaan gen resistensi kloramfenikol (cat) pada isolat klinik P. aeruginosa dan Escherichia coli. Bakteri diisolasi dari kasus infeksi di Rumah Sakit. Kemudian dilakukan identifikasi dengan metode uji biokimia, isolasi DNA, kemudian diamplifikasi dengan metode Polymerase Chain Reaction, dengan menggunakan dua pasang primer spesifik untuk kedua bakteri tersebut, dilanjutkan visualisasi hasil PCR dengan menggunakan elektroforesis. Hasil uji menunjukkan bahwa semua isolat P. aeruginosa terdeteksi adanya gen cat (100%), sedangkan E. coli terdeteksi gen cat sebesar 71,4%